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    實驗技術交流

    Western Blot的樣本制備

    文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2020/11/24     瀏覽次數:    
    Western Blot 是一種用于檢測蛋白質以及蛋白質翻譯后修飾的常用方法,可以對簡單或復雜生物樣品中的目標蛋白質進行半定量或定量分析。其操作步驟包括:

    1.從細胞、組織或體液中制備樣品(蛋白質提取和蛋白質濃度測量)
    2.十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠通過電泳按大小分離蛋白質
    3.將分離的蛋白質固定在硝酸纖維素(NC)膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上
    4.封閉膜上的非特異性蛋白
    5.用特異性一抗探測靶蛋白
    6.與標記的化學發光或熒光分子偶聯的二抗共孵育
    7.檢測反映抗原/抗體結合的信號

    8.使用軟件對目標蛋白條帶進行光密度分析


    Western Blot是分子生物學和蛋白質組學中最常用的技術之一。但Western Blot是一個多步驟的操作流程,因此任何一個步驟發生錯誤,都會導致最終的結果發生變異,從而降低了該技術的可靠性和可重復性。有研究表明,Western Blot的一些關鍵步驟,例如樣品制備方法、跑膠、轉膜、抗體的選擇以及定量所用的歸一化方法,對于可再現的蛋白質印跡結果至關重要。


    樣本制備

    Western blot步驟中的一個經常被忽視的方面是有效的樣品制備。有效的蛋白質提取和純化步驟對蛋白質印跡實驗的結果和解釋有重要影響。為了有效地提取蛋白質,應該選擇一種合適的均質化方法,該方法可以通過細胞膜的破裂有效地釋放細胞內的內容物。另外,應該選擇最佳的裂解緩沖液以促進蛋白質的正確溶解并防止蛋白水解降解,從而獲得大量的目標蛋白質。


    樣本制備的原則

    1.盡可能采取簡單方法,避免蛋白丟失;

    2.盡可能將所有待分析的蛋白質樣品全部溶解;
    3.細胞和組織樣品的制備應盡可能減少蛋白的降解,低溫和蛋白酶抑制劑防止蛋白降解;
    4.提取過程中避免蛋白產生聚集、沉淀和變性;
    5.防止發生人為的蛋白質樣品化學修飾(例如加入尿素不要超過37℃,防止氨甲?;揎椀鞍祝?;
    6.盡可能去除樣品中的非蛋白雜質和干擾蛋白;
    7.樣品裂解液新鮮配置,并分裝凍存于-80℃。勿反復凍融;
    8.制備方法應具有標準化、重現性、可靠性和簡便性。


    蛋白樣品的類型

    可溶性蛋白:

    培養細胞中可溶性蛋白,包括:細胞質中的可溶性蛋白、細胞周質蛋白、細胞器相關蛋白、分泌到培養基中的可溶性蛋白。
    自然宿主細胞中可溶性蛋白,包括:微生物、植物和動物細胞中的可溶性蛋白。

    不溶性蛋白:

    含包涵體的不溶性蛋白

    膜相關蛋白和難溶性蛋白(非重組蛋白)


    蛋白樣品的制備流程

    ? 組織、細胞或菌體的破碎和裂解
    ? 沉淀溶液中蛋白
    ? 清除雜質
    ? 蛋白濃縮、純化


    組織或細胞破碎和裂解

    為了全面分析細胞內的蛋白,需要對組織或者細胞進行有效地破碎和裂解,其方法取決于蛋白樣品的來源。同時,因細胞破碎時蛋白酶可能釋放出來,從而導致蛋白降解,影響后續實驗結果,因此需要加入蛋白酶抑制劑進行保護。


    破碎裂解的方法

    溫和破碎裂解法(針對組分單一或者分析某一特定組分):
    滲透裂解(血細胞、組織培養細胞):將細胞懸浮于滲透溶液中,細胞因腫脹而釋放細胞內容物。
    凍融裂解(細菌細胞、組織培養細胞):反復凍融裂解細胞,由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起腫脹,使細胞結構破碎。
    裂解液裂解(組織、培養細胞):含有去污劑的裂解液處理組織或細胞,使細胞膜破碎,細胞內容物釋放出來。
    酶裂解(植物、細菌、真菌細胞):利用酶裂解含有細胞壁的細胞。
    劇烈破碎裂解法(難于破碎細胞:固體組織、堅硬細胞壁):
    超聲裂解(懸浮細胞):利用超聲波產生的切應力來裂解細胞,超聲時應在冰上間歇進行。
    弗氏細胞壓碎器裂解(含有細胞壁的細胞):細胞懸液置于高壓下強力擠出小孔,壓力突然降低以及剪切力的作用導致細胞爆裂破碎。
    機械勻漿裂解(固體組織、細胞懸液):將組織剪成小塊,利用勻漿器在加蛋白酶抑制劑的勻漿液中破碎組織或者細胞。
    研磨法(固定組織、微生物):樣品凍存在液氮中,利用研缽和研杵快速將樣品研磨成粉狀。
    玻璃珠勻漿裂解(含有細胞壁的細胞):利用劇烈震蕩的玻璃珠打碎細胞的細胞壁,從而釋放細胞的內容物。


    裂解液一般組成

    緩沖液(Tris-HCl):提供pH環境,使蛋白保持穩定,增加溶解性。
    去污劑(表面活性劑):破壞蛋白之間的疏水相互作用,以確保蛋白完全溶解和防止通過疏水相互作用導致蛋白聚合。
    蛋白酶抑制劑:抑制蛋白酶的活性,防止蛋白被水解。
    磷酸酶抑制劑:抑制磷酸酶的活化,防止蛋白樣本脫磷酸化。
    還原劑:二硫鍵斷裂和蛋白質變性
    其它:NaCl,促進細胞膜破裂使蛋白溶解

    常見裂解液成分一覽表

    常用裂解液 常見裂解液成分 濃度 作用
    NP-40緩沖液, RIPA沖液,  Tris-Triton緩沖液, Tris-HCl緩沖液
    Tris-HCL
    50mM-100mM(pH 7.4-8.0)
    溶液pH緩沖
    NaCL 50mM-150mM
    細胞膜破裂和蛋白質溶解
    型去污劑:NP40, 辛基葡糖苷, Triton X-100, Tween
    0.1-2% 非極性不溶蛋白的溶解
    型去污劑:SDS, 脫氧膽酸鈉, CTAB 0.1-1%;0.1-0.5%;0.01-0.5%
    包被帶負電荷的蛋白質,并根據其分子量促進凝膠分離;難容蛋白的膜溶解
    兩性離子去污劑:CHAPS(CB3-10,ASB-14)
    2% 破壞蛋白質間的相互作用
    尿素 5-8M 破壞非共價相互作用并導致蛋白質變性
    EDTA 1-5mM 螯合金屬離子,減少氧化損傷并抑制金屬蛋白酶
    EGTA
    螯合金屬離子
    甘油 5-10% 穩定作用
    DTT 1-10mM 二硫鍵斷裂和蛋白質變性
    2-疏基乙醇 1-10mM
    二硫鍵斷裂和蛋白質變性
    TCEP 10-50mM 二硫鍵斷裂,破壞二級和三級結構
    Na3VO4 0.1-2mM 抑制酪氨酸和堿性磷酸酶
    NaF 50mM 抑制絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶
    蛋白酶抑制劑,磷酸酶抑制劑,cocktail
    預包裝的片劑或液體形式
    抑制蛋白水解,抑制磷酸酶的活化


    蛋白酶抑制劑的種類

    常用的蛋白酶抑制劑:
    絲氨酸蛋白酶抑制劑:PMSF,AEBSF-HCl,Aprotinin(抑肽酶), Chymostatin,亮肽素(Leupeptin)。
    天冬氨酸蛋白酶抑制劑:PMSF,碘乙酸、抑肽素(Pepstatin),云芝發酵物。
    巰基蛋白酶抑制劑:PMSF,TLCK,TPCK,Antipain-HCl,N-乙基順丁烯二酰亞胺。
    金屬蛋白酶抑制劑(金屬離子螯合劑):EDTA,EGTA,塔羅肽。
    (磷酸酶抑制劑:NaF、激活的原礬酸鈉、焦磷酸鈉、β-甘油磷酸鈉。)

    常見裂解液成份一覽表

    抑制劑 工作濃度 分子量 抑制蛋白酶種類 穩定性
    AEBSF 1mM MW:239.5
    不可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑,抑制胰蛋白酶,糜蛋白酶,纖溶酶,凝血酶及激肽釋放酶。
    可溶于水,其pH7 的水溶液在4oC 可保持穩定 1-2 個月,在pH>8 的情況下會發生緩慢水解
    Aprotinins抑肽酶
    2μg/ ml
    MW:6512
    可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑,可抑制纖溶酶,激肽釋放酶,胰蛋白酶,糜蛋白酶,但不抑制凝血酶和Factor Xa。
    非常穩定,當  pH>12.8 時失去活性,可溶于水(10mg/ml),-20oC 下可長期保存。
    EDTA,4Na
    10mM
    MW:380.2
    金屬蛋白酶的可逆性螯合物,可能同時影響其他金屬依賴性生物過程。
    其水溶液很穩定,其貯存液(pH8.5 的 0.5M水溶液)在 4oC 可保存數月
    Leupeptin, 半硫酸鹽
    亮抑酶肽(亮肽素)
    100μM
    MW:493.6
    可逆的絲氨酸及半胱氨酸蛋白酶制劑,可抑制胰蛋白酶樣蛋白酶及一些半胱氨酸蛋白酶如:Lys-C 內切蛋白酶,激肽釋放酶,木瓜蛋白酶,凝血酶,Cathepsin B 及胰蛋白酶。
    可逆的絲氨酸及半胱氨酸蛋白酶制劑,可抑制胰蛋白酶樣蛋白酶及一些半胱氨酸蛋白酶如:Lys-C 內切蛋白酶,激肽釋放酶,木瓜蛋白酶,凝血酶,Cathepsin B 及胰蛋白酶。
    Pepstatin A
    1μM
    MW:685.9
    可逆的天冬氨酸蛋白酶,可抑制胃蛋白酶, Cathepain B&L,血管緊張肽原酶(renin)。
    以 1mg/ml  溶于甲醇,攪拌過夜可以1mg/ml 溶于乙醇,333mg/ml 溶于 6N 的
    PMSF
    1mM
    MW:174.2
    不可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑,可抑制羧肽酶 Y, 糜蛋白酶,Factor  Xa,木瓜蛋白酶,纖溶酶,蛋白酶K,枯草桿菌蛋白酶,凝血酶及胰蛋白酶。
    有毒!請現配現用,并在樣本處理過程中分批加入(勿一次性加入),在 pH7.5 時半衰期為一個小時,貯存液(200mM 的甲醇或乙醇溶液)在 4oC 可保存 9 個月以上
    抑肽素 A


    很多細菌來源的天冬氨酸蛋白酶,與蛋白酶有微弱的結合。
    乙酸,4oC  下可保存一周。
    Trypsin Inhibitor,
    Soybean
    與需抑制的蛋白酶等摩爾濃度
    MW:20000
    可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑,抑制 Factor Xa 及胰蛋白酶
    在低 pH 值情況下分解,其貯存液在-20oC時相當穩定。
    Amastatin
    10μM
    MW:474.6
    可逆的丙氨酰-氨基肽酶抑制劑
    其水溶液只可保存一天,其 1mM 的乙醇溶液在-20oC 可保存一個月
    Antipain,2HCl
    100μM
    MW:677.6
    可逆的絲氨酸和半胱氨酸的蛋白酶抑制劑,可抑制木瓜蛋白酶及胰蛋白酶.對纖溶酶也有一定抑制作用.與Leupeptin  相比,它對木瓜蛋白酶和胰蛋白酶有更強的特異性。
    工作液穩定期僅為數小時,但其10mM 的水(或緩沖液)溶液貯存液在  4oC 可保存一周,在-20oC 可保存一個月,還可溶于甲醇或DMSO。
    Chymostatin
    100μM
    MW:604.9
    可逆的 半胱氨酸絲氨酸蛋白酶抑制劑,可抑制糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶,包括lalpha-,beta-,gamma-及 delta-糜蛋白酶

    TLCK
    100μM
    MW:369.3
    不可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑,抑制胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶,包括菠蘿蛋白酶,Arg-C 內切蛋白酶, 無花果蛋白酶,木瓜蛋白酶,纖溶酶,凝血酶及胰蛋白酶
    pH>7.5 時非常不穩定,貯存液(10mM  的1mM HCl,pH3.0 的水或甲醇溶液)也應該現配現用
    TPCK
    10μM
    MW:351.5
    不可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑,抑制胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶,包括菠蘿蛋白酶,糜蛋白酶,無花果蛋白酶及木瓜蛋白酶。
    工作液穩定期為幾個小時,貯存液(10mM 甲醇溶液)在  4oC 下可保持穩定幾個月。

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