• <optgroup id="kce24"><samp id="kce24"></samp></optgroup>
  • <sup id="kce24"></sup>
  • 今天是2021年10月11日 星期一,歡迎光臨本站 

    實驗技術交流

    凝膠阻滯實驗原理及步驟(精品教程)

    文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2019/10/9     瀏覽次數:    

    凝膠阻滯(遷移)實驗(EMSA,electrophoretic mobility shift assay),是一種研究蛋白與核算相互作用的技術??捎糜隍炞C轉錄因子與啟動子相互作用的,也可用于蛋白-DNA、蛋白-RNA相互作用。今天我們就為大家介紹一下凝膠阻滯實驗原理及步驟,跟著做,你也能一步一步完成凝膠阻滯實驗。


    實驗原理

    凝膠阻滯實驗原理示意圖


    實驗主要基于蛋白-探針復合物在在凝膠電泳過程中遷移較慢的原理。根據實驗設計特異性和非特異性探針,當核酸探針與樣本蛋白混合孵育時,樣本中可以與核酸探針結合的蛋白質與探針形成蛋白-探針復合物;這種復合物由于分子量大,在進行聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移較慢,而沒有結合蛋白的探針則較快;孵育的樣本在進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜后,蛋白-探針復合物會在膜靠前的位置形成一條帶,說明有蛋白與目標探針發送互作。


    實驗步驟

    1.實驗前準備

    (1)合理的實驗方案

    根據研究目的合理設計特異性探針實驗組以及非特異性探針對照組,如有必要還可以添加特異性抗體組、特異性核酸競爭組等。


    (2)樣本制備
    可以選擇提取樣本的總蛋白、核蛋白或者使用純化好的目的蛋白。對樣本蛋白進行定量,實驗中等量加入蛋白。


    (3)探針制備
    根據實驗要求設計不同的探針并添加標記,可以合成核酸后自行添加,部分已知蛋白有商業化的抗體也可以直接購買?,F在大多數實驗室已經不再使用放射性標記,生物素使用相對較多。


    2.形成蛋白-探針復合物

    (1)在0.5ml離心管中按順序將下列組份混勻:

    蛋白樣本(2-5μg)
    Xμl

    poly d(I-C)

    1μl

    Binding Buffer

    2μl

    Nuclease-Free ddH2O

    Xμl
    總體積 9μL


    2)冰浴5min后,加入1μ探針。(對照組加1ul對照探針)

    (3)PCR儀中室溫(20-23℃)溫育30min。


    3.制備凝膠電泳

    (1)制備6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠:(注意根據試劑情況按比例調整總體積)

    5X TBE

    1ml

    30% Acrylamide/Bis

    2.2ml

    deionized,sterilewater

    6.62ml

    80% Glycerol 80μl
    10% AP 90μl
    TEMED 10μl
    總體積 10ml


    (2)按標準步驟制備凝膠。

    (3)加樣前先在預冷的0.5X TBE buffer中120V預電泳10min,與電泳完畢后沖洗加樣孔。


    (4)混合樣本及電泳緩沖液,點樣電泳。

    (5)將電泳槽置于冰上或者4℃環境中,恒壓100V進行電泳,直至緩沖液指示帶距離凝膠底部2~3cm為止。(大約50-60min,根據實際情況調整電泳時間及電壓;電泳時間不宜過長)


    4.轉膜

    (1)在預冷的0.5XTBE中浸泡凝膠,膜,濾紙和纖維墊。

    (2)按如下順序組裝“三明治”:纖維墊,濾紙,凝膠,膜,濾紙,纖維墊。注意電極,確保凝膠位于陰極、膜位于陽極。

    (3)在預冷的0.5XTBE中進行轉膜。轉膜裝置應置于冰上或者低溫室中,恒壓60V轉膜1h。(注意根據實際情況調整電壓及時間)。

    5.檢測

    (1)去除轉好的膜,放入合適的盛有緩沖液的容器中,沖洗。(注意整個檢測過程避免膜干燥)

    (2)去掉沖洗緩沖液,加入封閉液后輕微震蕩,室溫封閉20min。

    (3)加入適量的HRP酶標記的鏈霉親和素(Streptavidin-HRP conjugate),室溫震蕩孵育45min。(勿將酶標記物直接加到膜上)

    (4)去掉酶聯物稀釋液,用洗滌緩沖液洗膜三次,每次室溫輕微震蕩1 0min。

    (5)配置反應底物,均勻加至膜上,室溫孵育5min。(可以在加完底物后,用薄膜輕輕覆蓋在膜上,是底物均勻覆蓋,注意不要產生氣泡)

    (6)化學發光成像系統曝光成像(曝光時間的長短可以根據檢測方法不同而進行相應調整)。


    返回上一步
    打印此頁
    +86 189-4987-4361
    0551-63822150
    掃碼添加微信
    微信二維碼
    成人有色视频免费观看网址,最新国产一卡二卡三卡四卡,天堂www天堂网在线最新版,yy111111电影院少妇影院 <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <文本链> <文本链> <文本链> <文本链> <文本链> <文本链>