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    實驗技術交流

    體外診斷中的核酸提取純化

    文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2019/11/19     瀏覽次數:    

    體外診斷是指利用人體血液、體液、組織等樣本,進行檢測,從而得到診斷信息并對疾病或身體機能進行判定的服務或產品。想要對人體樣本進行檢測其中的一項關鍵工作是需要對樣本核酸進行純化,而核酸純化方法是影響所提取核酸質量的重要因素。因此,得到高質量的核酸尤為關鍵!下面為大家列舉了幾種體外診斷中核酸的純化方法:


    1.速率曲帶離心法

    在此法中,密度梯度液頂部的狹窄樣品區帶被分層,從而避免不同沉降速率的顆粒之間交叉污染問題,(見圖1)。然而,由于上樣區帶狹窄,因此限制了可容納在密度梯度液之上的樣品量(通常為10%)。

    梯度液可以穩定區帶,并且可以增加密度和粘度。當區帶中的顆粒向下移動通過密度介質時,移動速度較快的顆粒就會先于移動較慢的顆粒,從而形成含有類似大小顆粒的各個區帶。
    此法的缺點是:

    ① 離心時間較長
    ② 需要制備惰性梯度介質溶液
    ③ 操作嚴格,不易掌握


    2.苯酚- 氯仿萃取

    苯酚和氯仿均為有機溶劑,其萃取核酸原理是苯酚與氯仿對于與核酸結合的蛋白質有極強的變性作用,但對核酸本身沒有影響。經離心后,形成上層水相下層酚/氯仿相,變性后的蛋白質溶于酚/氯仿相或者在兩相交界處形成凝膠層,而核酸易溶于水而不溶于有機溶劑從而留在水相;同時,氯仿可以有助于有機相與水相的分離和去除溶于水的部分酚。最后,再將核酸通過乙醇沉淀即可達到提取的目的。
    此法的缺點是:

    ① 蛋白質難以徹底去除
    ② 操作難度大且費時
    ③ 使用危險化學品


    3.離心柱純化

    此種方法是利用核酸表面會覆蓋一層由水分子構成的薄膜,在高鹽環境下,這層親水膜會遭到破壞從而核酸可被吸附在離心柱上,而其他雜質如蛋白質、代謝產物等則會被離心沉淀與核酸分離。最后通過洗脫,將核酸從吸附膜上脫離,即可得到純化后的核酸。離心柱純化也是的試劑盒提取中廣泛的使用方法。

    此法缺點如下:

    ① 高度依賴吸附膜的結合能力
    ② 洗脫不完全導致核酸流失
    ③ 無法大量提取核酸


    離心柱純化法示意圖


    4.磁分離法

    攜帶正電荷的磁珠易于吸附負電荷的核酸,主要用于從人血清或血漿樣品中提取DNA 和RNA(例如從血液樣本中檢測HIV 或HBV 病毒基因組的樣品制備)。一般而言,將樣品與結合緩沖液和磁珠混合,核酸與磁珠結合后,經過數次洗滌與磁場捕獲,洗脫下來的核酸即可通過PCR 或其它特定方法來檢測特定的DNA 或RNA。磁分離法也是廣泛應用于診斷行業,且能實現高通量、自動化的核酸提取方法。

    磁珠法核酸提取流程示意圖


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