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    實驗技術交流

    凝膠阻滯實驗問題總結

    文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2019/11/19     瀏覽次數:    

    本文主要對凝膠阻滯實驗中常見的問題進行總結分析供大家學習交流。

    1.為什么看不到遷移帶?

    ① 蛋白降解或蛋白提取量不足

    ② 樣本中沒有可以與探針結合的蛋白

    ③ 探針與蛋白無特異性相互作用

    轉膜效率低,蛋白或者探針未轉移到膜上

    ⑤ 曝光或者成像時間過短

    在Super-Shift EMSA測定中看不到Super-Shift DNA/蛋白復合物帶還可能有以下原因:

    ⑥ 抗體沒有工作。不是所有的抗體都可以用于Super-Shift EMSA,只有對非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應的抗體才能夠用于Super-Shift EMSA
    ⑦ 測定的活化的DNA/蛋白復合物中沒有希望檢測的構成成分存在。此時既看不到Super-Shift的帶,也看不到DNA/蛋白復合物的量的減少
    ⑧ 使用的抗體過度稀釋。一般10-20ul的反應液需要使用0.5-1ul原倍的抗體
    ⑨ 多抗與DNA/蛋白復合物形成大的聚集物而不進膠。在這種情況下,雖然看不到Super-Shift的帶,但應當可以看到DAN/蛋白復合物的電泳帶明顯減少


    2.為什么實驗背景高?
    ① 曝光或者成像時間過長
    ② 封閉時間不足或者效率不高
    ③ 洗滌效果不佳
    ④ 實驗過程中膜沒有一直處于濕潤狀態


    3.EMSA測定需要多少量的蛋白與標記的探針?
    ① 對每一個特定的結合蛋白和探針,所用的純化蛋白,部分純化蛋白,粗制核抽提液需作優化:一般所用純化蛋白的量在20-2000ng間,可將蛋白:DNA的等摩爾比調整為蛋白的摩爾數是DNA的5倍;用粗制核抽提液,需要2-10ug蛋白形成特異的復合物
    ② 部分純化蛋白與粗制核抽提液應保存在-80℃、探針應保存在-20℃以防止降解
    ③ 無論探針或是結合蛋白都應避免多次凍融


    4.Poly(dI:dC),非特異性競爭DNA,特異性競爭DNA在EMSA測定中的作用?
    Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶組成。在EMSA反應中加入poly(dI:dC),可抑制粗制核抽提液中轉錄調節因子與標記探針的非特異結合。結合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式實驗前進行優化,一般用量大約在0.05mg/ml左右。當用純化的蛋白作凝膠遷移反應時,不必一定加入poly(dI:dC),如加入,則普通反應中所用終濃度不超過50-100ng。對核抽提液,每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。
    為確定所形成的復合物的特異性,在含或不含增量的特異競爭DNA或非特異的競爭DNA時,作結合反應的競爭實驗。一般,特異競爭探針是非標記的DNA,其序列與標記探針相同,故能與標記探針競爭與結合蛋白的反應。非特異競爭探針的長度組成和DNA探針相同,但序列不同。如果結合蛋白與標記探針的結合被特異競爭探針抑制,而不受非特異探針的影響表明靶結合蛋白的存在。特異與非特異性競爭DNA的用量也需優化或滴定,但競爭DNA通常是標記的探針用量的30-100倍(w/w)。


    5.用什么凝膠條件將蛋白質/探針復合物和游離的探針分離開?
    將結合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結合,蛋白/探針復合物和游離探針可在非變性聚丙烯酰胺凝膠中經電泳分離。聚丙烯酰胺的濃度一般為6%,在特定條件下可用高或低的濃度。也可將TGE緩沖液(12.5mM Tris,pH8.3,95mM 甘氨酸,0.5mM EDTA)用于不穩定的蛋白/DNA復合物。在4℃進行結合和電泳實驗以阻止不穩定復合物和探針的解離。
    當帶型不緊密出現拖尾時,表明復合物存在解離。凝膠必需完全聚合,以避免帶型拖尾。如復合物不進入凝膠則表明所用的蛋白或探針過量,或鹽的濃度過量不適用于這一反應。在含抽提液的帶中不含游離探針或復合物,但只含探針的帶中有探針表明抽提物有核酸或磷酸酶污染,應在抽提液中和結合反應中加入相應的抑制劑。

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