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    實驗技術交流

    科學家發現新冠檢測新方法比RT-QPCR還快,45分鐘出結果

    文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2020/2/28     瀏覽次數:    

    自2020年以來,新型冠病毒(2019-nCoV)一直威脅著人們的健康,盡管它和SARS相似,但無疑的是這種病毒的傳染性更強?,F有的RT-qPCR檢測方法對人員和設備要求較高,因此迫切需要找到一種快速、簡便的檢測方法。

    不久前,medRxiv分別發布了沈陽化工大學應用生物學研究所所長尹秀山博士團隊和美國密歇根皇家橡樹博蒙特Michael B Chancellor團隊帶來的報告,揭示了兩種操作簡單,且能再45分鐘內出結果的新方法。據悉,這兩種方法是通過逆轉錄環介導等溫擴增(RT-LAMP)技術探索出的快速檢測病毒新方法。
    通過RT-LAMP可將環介導等溫擴增(LAMP)和反轉錄結合,直接檢測出RNA,通過與反應混合物中的pH指示劑耦合,檢測人員就可以通過顏色的變化知道檢測結果。



    iLACO可檢測出低至10個拷貝的ORF1ab基因


    https://doi.org/10.1101/2020.02.20.20025874

    https://doi.org/10.1101/2020.02.20.20025874


    在這項研究中,研究人員通過制備合成ORF1ab基因序列的基因稀釋液(從1,000,000到10份拷貝)等多個反應物,結果發現iLACO非常敏感,能夠檢測到低至10份拷貝的ORF1ab基因。為了擴大iLACO的檢測能力,他們將新型核酸染料GeneFinderTM添加至反應混合物中,并在65℃溫育一段時間后放在藍光下,結果發現陽性組肉眼可見明顯的綠色熒光,而陰性組則保持粉色不變。


    陽性組和陰性組在藍光下呈現不同顏色

    陽性組和陰性組在藍光下呈現不同顏色

    那么iLACO對新冠病毒的檢測能力如何?為此,研究人員評估了沈陽2020年以來經過RT-QPCR初診的43個樣本,結果發現97.6%(42/43)經qPT-PCR驗證的樣品與2 μl樣本孵育40分鐘后顯示出一致的信號,只有一個樣本在50分鐘后顏色保持不變,表明低劑量病毒會導致假陰性或自發性陰性信號。

    由于RT-qPCR檢測大多使用5μl樣品輸入,為此研究人員特地增加了檢測樣本量以探究其是否有助于檢測,然而結果卻是和先前檢測時不一致。研究人員推測這可能是RNA稀釋緩沖液中存在Tris或EDTA導致的,因此可以通過調整緩沖液濃度來優化。


    RT-LAMP 63°C下溫育30分鐘可獲最佳擴增結果


    而來自Michael B Chancellor團隊的報告中,研究人員使用由COVID-19武漢-湖-1(Wuhan-Hu-1)完整基因組(MN908947)的核苷酸2941-3420設計的COVID-19 PCR標準,對幾種引物、溫度范圍(57-65°C)和孵育時間(15-45分鐘)進行了檢測,確定了RT-LAMP的最佳條件。在63°C下溫育30分鐘可獲得最佳擴增結果。

    https://doi.org/10.1101/2020.02.19.20025155

    https://doi.org/10.1101/2020.02.19.20025155

    進一步,研究人員對COVID-19、MERS、BtCoV以及MHV病毒進行了系統特異性測試,結果顯示該系統僅對COVID-19的樣本有反應,使用人體血清、尿液、唾液、口咽拭子和鼻咽拭子均可成功地完成RT-LAMP。

    從左至右分別為血清、尿液、唾液、鼻咽拭子、口咽拭子的檢測結果

    從左至右分別為血清、尿液、唾液、鼻咽拭子、口咽拭子的檢測結果

    此外,研究人員還將RT-LAMP引物的序列與SARS和與感冒相關的冠狀病毒的序列進行了比對,結果發現這些冠狀病毒與RT-LAMP引物存在27-54%的核苷酸不匹配,這表明它們不可能檢測出RT-LAMP陽性結果??紤]到病毒可能發生突變,研究人員還檢查了RT-LAMP引物是否與來自其他地點的27個不同COVID-19分離株存在不匹配現象,結果發現不匹配度為0。

    盡管這項研究存在一些局限,比如COVID-19是生物安全級別,由于無法直接檢測相關病毒而使用了來自這些病毒相同區域的核苷酸寡核苷酸,但是這些實驗確實證明了該方法的可行性以及對COVID-19的特異性,對于潛在感染者的篩查和病毒檢測具有很大的價值。
    這兩項研究旨在尋找到比RT-qPCR檢測更加快速、準確且簡單易上手的病毒檢測方法,這些方法對于社區和普通人群檢測是否感染病毒具有重要意義。

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